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                          首 頁 > 最新資訊 > 行業資訊|關于疫苗中Vero傳代細胞DNA殘留檢測技術

                          行業資訊

                          行業資訊|關于疫苗中Vero傳代細胞DNA殘留檢測技術

                          生物制品攜帶的宿主殘留DNA具有傳遞外源DNA的潛在危害,因此去除宿主DNA,預防可能出現的不利后果是極為必要的。宿主細胞殘留DNA作為生物制品安全性評價的一個重要指標,各國藥品監督管理機構對其殘留量有著嚴格的限度控制。君研生物自主研發的Vero殘留DNA檢測試劑盒能快速、特異地檢測生物制品中成品,半成品和中間品中DNA殘留量。

                          多年來,國外已成功的研制了采用Vero細胞生產疫苗并獲準上市,包括人用狂犬病純化疫苗、脊髓灰質炎滅活(純化)疫苗(IPV),并在中國注冊或正在注冊申請中。在上世紀九十年代后,國產的采用Vero細胞生產的人用狂犬病純化疫苗、乙型腦炎純化疫苗、腎綜合征出血熱純化疫苗被批準上市。近年來,又有一些企業申請乙型腦炎純化疫苗、脊髓灰質炎滅活(純化)疫苗、甲型肝炎滅活疫苗進行臨床研究或上市。隨著采用Vero細胞生產疫苗種類的增多,并且使用人群擴大到嬰幼兒,其細胞殘留物質越來越受到關注,已成為我們審評中重點考慮的問題之一。

                          Vero細胞的正式名稱為“非洲綠猴腎細胞”,是傳代細胞的一種。所謂傳代細胞可簡單的理解為,在體外可以連續傳代的細胞系,理論上具有無限傳代的壽命。傳代細胞系可以通過以下方法衍生而來。

                          正常細胞群的連續傳代,繁衍成一個新的具有無限壽命的細胞群,例如非洲綠猴腎細胞的傳代細胞系Vero細胞;人或動物腫瘤細胞的原代細胞的系列培養,例如Hela細胞、Namalva細胞等;攜帶致癌基因的病毒,將致癌基因轉化給正常細胞,成為腫瘤細胞,例如EB病毒轉化的B淋巴細胞;骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合,例如生產單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

                          由于腫瘤細胞或攜帶腫瘤基因的細胞具有致腫瘤的危險,所以該類細胞不能作為細胞基質用于疫苗生產;因此用于疫苗生產的細胞系均采用非腫瘤細胞系,即正常細胞群的連續傳代后繁衍的細胞系,在一定傳代限度內使用,目前使用的Vero細胞屬于此類。Vero細胞由于具有傳代細胞特性,因此也存在理論上的潛在致腫瘤性。目前WHO認為130~150代細胞無致腫瘤性,可以用于疫苗的生產。目前國內研制的Vero細胞基質的疫苗,細胞致腫瘤試驗均為陰性,已批準上市多年的產品,未見有安全性方面的問題。有報導超過170代的Vero細胞致腫瘤試驗陽性。

                          由于傳代細胞調控生長的基因失調,使得傳代細胞系具有無限的壽命。因此,理論上認為傳代細胞系的DNA具有使其他細胞生長失控和產生致腫瘤活性的潛在能力,因此需對疫苗的Vero細胞殘余DNA進行質量控制。傳代細胞可分泌生長因子(稱促生長蛋白),該生長因子可以促進細胞生長,在異常情況下有致腫瘤作用,并需要持續作用。鑒于目前國際上尚無特異性Vero細胞蛋白的檢測手段,現仍以疫苗蛋白總量進行間接質控。

                          綜上所述,Vero細胞生產疫苗具有理論上的潛在致腫瘤性風險,控制該風險的措施有兩個方面,其一為控制Vero細胞的代次在130~150代,其二為降低Vero細胞殘余DNA含量、殘余蛋白含量(通過總蛋白含量進行間接質控)。目前國際上及國外公司對Vero細胞殘余DNA含量、總蛋白含量的控制標準內容為:
                          1)WHO的標準比較寬松,無論是否用于嬰幼兒的,均控制在≤10ng/劑量;
                          2)歐盟相對于WHO,提高了嬰幼兒使用疫苗的要求,嬰幼兒疫苗≤100pg/劑量,非嬰幼兒疫苗≤10ng/劑量;
                          3)已知的兩國外公司對嬰幼兒疫苗更提高了要求,控制在≤10pg/劑量。一家訂入規程,一家作為內控標準。
                          4)我國上市的狂犬病疫苗≤100pg/劑量,相當于歐盟的嬰幼兒使用疫苗的要求。
                          5)我國上市的乙型腦炎純化疫苗(04年上市)使用人群包括嬰幼兒,控制在≤10ng/劑量,符合WHO通則、歐盟通則、WHO對嬰幼兒疫苗的要求,達不到歐盟對嬰幼兒疫苗的要求(≤100pg/劑量),更達不到外企的控制標準(≤10pg/劑量)。
                          6)腎綜合征出血熱純化疫苗(02年上市)使用人群為成人,控制在≤10ng/劑量, 符合WHO通則、歐盟通則要求。

                          關于總蛋白含量,因疫苗(病毒蛋白)的免疫原性不同,每種疫苗不盡相同,國際上對IPV要求為≤10ug/劑量;我國要求狂犬病疫苗≤120ug/劑量;據調研,乙型腦炎的劑量≤10ug蛋白具有較好的免疫原性。在此需指出,無論是WHO、歐盟還是中國藥典的要求,均為最低要求,企業需在滿足上述相關要求的基礎上提高要求并擬定注冊標準。

                          對于我國企業采用Vero細胞生產疫苗,需按照注冊申請的擬定注冊標準(參見2004年3月12日刊登在CDE網站的《關于對預防用生物制品注冊標準的理解和擬定原則的考慮》),其中包括Vero細胞DNA殘余量及總蛋白殘余量,建議在擬定注冊標準時作如下考慮:

                          1. 加強去除細胞DNA和去除雜蛋白(細胞蛋白)的工藝研究,最大限度的降低DNA殘余量和總蛋白含量。尤其是用于嬰幼兒的疫苗(如IPV、乙型腦炎疫苗等),最好能控制在DNA殘余量≤10pg/劑量,總蛋白含量≤10ug/劑量。

                          2. 對于達不到DNA殘余量≤10pg/劑量,總蛋白含量≤10ug/劑量的產品,不建議在2歲以下嬰幼兒人群中使用。

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